全基因合成簡(jiǎn)介

在我們的實(shí)驗工作中，如果采用一般實(shí)驗手段無(wú)法得到目的基因時(shí)，可以進(jìn)行實(shí)驗室人工合成。公司擁有成熟的基因合成技術(shù)，可根據客戶(hù)要求，以具競爭力的價(jià)格和快捷的交貨周期提供全基因合成服務(wù)及相關(guān)服務(wù)。合成的基因可以根據客戶(hù)的需求連接到不同的載體上，最終提供的產(chǎn)品包括合成報告、測序報告、質(zhì)粒酶切圖譜、凍干質(zhì)粒以及含有該質(zhì)粒的菌株。 

 一、應用領(lǐng)域：

1. 基因突變 / 重組 / 高效表達。

2. 其他方法難以獲得的 cDNA。

3. 合成不同的基因變異或新基因。

4. 用于微芯片的大量 cDNA 。

二、服務(wù)特色： 

1. 免費提供基因的參考設計方案，包括設計酶切位點(diǎn)，密碼子優(yōu)化等。

2. 基因合成周期短，嚴格按照與用戶(hù)簽定的基因合成服務(wù)協(xié)議和保密合同執行。

3. 能合成長(cháng)度達 10 kb 的基因。

4. 基因克隆到用戶(hù)指定或提供的表達載體上。

5. 質(zhì)量可靠，提供 DNA 測序結果，保證所合成的基因序列100% 準確。

三、服務(wù)流程： 

1. 收到客戶(hù)提供序列后，確定使用何種酶切位點(diǎn)克隆，克隆到何種載體等等，然后對全序列進(jìn)行編輯，傳至客戶(hù)確認。

2. 經(jīng)分析確認達成一致意見(jiàn)后，簽訂基因合成服務(wù)協(xié)議與保密合同?；蚝铣煞?wù)協(xié)議簽定后，客戶(hù)需預付50% 的合成費用，本公司方開(kāi)始合成。交貨期也從即日開(kāi)始。

3. 設計Oligo合成方案，在全自動(dòng)合成儀器上進(jìn)行單鏈的化學(xué)合成。

4. 通過(guò)OVER-LAP的PCR，把單鏈Oligo拼接成雙鏈的全長(cháng)基因。

5. 將PCR產(chǎn)物酶切、純化，連接到質(zhì)粒中，將質(zhì)粒轉入細胞株培養。

6. 提取陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測序，確認插入片段的準確性。

7. 對可能存在的錯誤位點(diǎn)用定點(diǎn)突變的方法加以改正，再經(jīng)測序驗證。

8. 提供實(shí)驗報告，包括裝載目的基因的質(zhì)粒、細菌株、測序圖譜 / 序列。

9. 合成完畢后，本公司通知客戶(hù)，收到全部貨款，本公司開(kāi)始發(fā)貨 。

四、情況說(shuō)明 

1. 由于基因結構的復雜性，并不是所有的片段都能順利合成。對于較長(cháng)的片段或一些復雜結構如重復序列、高 GC 片段等，可能會(huì )需要額外的時(shí)間調整合成方案。如果發(fā)生這種情況，技術(shù)人員會(huì )及時(shí)與您聯(lián)系，告知您合成進(jìn)程。

2. 所合成的基因一般克隆于通用載體中，如需克隆在客戶(hù)指定的載體中，我公司會(huì )酌情再收取一定的費用，并且交貨時(shí)間會(huì )適當延長(cháng)。

五、密碼子優(yōu)化：

　　對于密碼子優(yōu)化服務(wù)，在提供需要優(yōu)化和合成的基因序列的同時(shí)，我們還需要如下訊息：

1. 需要合成的蛋白或 DNA 序列。

2. 宿主表達系統。

3. 兩端的限制性酶切位點(diǎn)。

4. 優(yōu)化后的序列中需要避免的限制性酶切位點(diǎn)。

5. 優(yōu)化后的序列中需要保留的限制性酶切位點(diǎn)。

六、合成完成后向客戶(hù)提供的技術(shù)資料與產(chǎn)品 

1. 不少于2ug的含目的基因的通用載體質(zhì)粒一份。

2. 含上述質(zhì)粒的大腸桿菌菌株一份。

3. 基因序列100%正確的原始報告測序正本一份。

4. 基因合成報告一份。

七、全基因合成服務(wù)要求 

1.  請將您需要合成的基因全序列以 E-mail 或傳真的形式告知公司的業(yè)務(wù)員或公司的技術(shù)員。

2.  請說(shuō)明實(shí)驗的具體要求，如：使用何種酶切位點(diǎn)進(jìn)行克隆以及需克隆于何種載體等。

3.  測序結果如果發(fā)現有錯誤位點(diǎn)，我們會(huì )采取相應的技術(shù)手段進(jìn)行修復校對，保證整個(gè)序列的正確性。

4.  提供實(shí)驗結果：包括實(shí)驗操作規程、測序結果、測序彩色峰圖、含有合成基因的質(zhì)粒及含該質(zhì)粒的菌體( 穿刺菌 )等。

定點(diǎn)突變

通過(guò)實(shí)驗方法可以有效地向目的基因片段中引入任何所需的 DNA 變異，包括堿基添加、刪除、點(diǎn)突變等。

（一）服務(wù)要求

1. 請您通過(guò)業(yè)務(wù)員或技術(shù)員提供需要進(jìn)行突變基因的全部詳細序列；突變前序列請標注為： Wild sequence ；突變后序列請標注為： Mut sequence 。
2. 請提供突變基因克隆操作的詳細背景資料，例如使用何種限制酶酶切位點(diǎn)、克隆于何種載體等。
3. 請說(shuō)明實(shí)驗的具體要求，詳細情況請參考如下：

客戶(hù)常問(wèn)的幾個(gè)問(wèn)題：

1.如果想在貴公司做與基因工程相關(guān)的技術(shù)服務(wù)，該如何聯(lián)系?

可以直接通過(guò)業(yè)務(wù)員或公司的技術(shù)部聯(lián)系；同時(shí)提供詳細的背景資料、實(shí)驗要求等。技術(shù)人員經(jīng)過(guò)研討后將與您聯(lián)系，共同制定實(shí)驗方案，并告知您具體的服務(wù)價(jià)格和完成時(shí)間；我們將在收到您同意實(shí)驗的文字資料與實(shí)驗材料后立即開(kāi)始實(shí)驗。

2.貴公司對我們提供的實(shí)驗材料有何具體要求?

（1） 對實(shí)驗材料中涉及病原體等危險的材料拒絕接受。
（2） 在實(shí)驗材料中涉及到的堿基序列必須以電子版的形式提供. 
（3）實(shí)驗中使用的載體等要盡量提供詳細的背景資料（如質(zhì)粒大小、抗性、拷貝數、多克隆位點(diǎn)等 ） ；如 果為商品化載體，請提供生產(chǎn)廠(chǎng)家及標準名稱(chēng)；如果所提供載體是您自己構建的，請注明大體結構情況。
（4）實(shí)驗中如果使用氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素以外的抗生素時(shí)，抗生素需您自己提供。
（5）您自己提供的引物如果為干品，請標明具體的 OD 數；如果為液體狀態(tài)，請標明具體濃度。
（6） 可用甘油菌和穿刺菌的形式郵寄菌體（最好同時(shí)提供相應質(zhì)粒 ） ；如果提供質(zhì)粒，則質(zhì)粒的量最好在 4 mg以上；如果提供的是 PCR 產(chǎn)物，則 PCR 產(chǎn)物量最好在 5 mg 以上（最好附有電泳照片 ）。
（7） 用于提取 RNA/DNA 的材料要新鮮，采樣時(shí)液氮中速凍后保存于 -80 ℃ 冰箱中，并使用液氮或干冰運輸。
（8） RNA 樣品最好用干冰運輸，如果確實(shí)沒(méi)有條件，可將 RNA 沉淀，在含有沉淀的離心管中加入 100% 乙醇，用冰袋運輸。

3.貴公司能免費提供哪些載體和引物?

公司免費提供測序及 PCR 擴增用的通用引物： Bca BEST Primer M13(-47) 、 Bca BEST Primer RV-M 、 T3 Promoter 、 T7 Promoter 、 AOX 3" 、 AOX 5" 、 pGEX 3" 、 pGEX 5" 以及 SP6 Promoter 等。

4. 基因工程操作服務(wù)通常耗時(shí)較長(cháng)，如果想了解實(shí)驗進(jìn)展情況該怎么辦?

公司在每周五以 E-mail 的形式將實(shí)驗進(jìn)展的大體情況通知客戶(hù)；您也可以向業(yè)務(wù)員查詢(xún)；也可以直接與技術(shù)人員交流溝通。

（二）操作程序

1. 具體聯(lián)系方式請參考“ 客戶(hù)常問(wèn)的幾個(gè)問(wèn)題 ”。
2. 如您提供的模板序列為非公司的測序結果，我們將首先對模板進(jìn)行測序并將與您溝通測序結果。
3. 根據突變方案設計合成突變引物，進(jìn)行基因突變實(shí)驗的 PCR 反應，克隆變異體。
4. 進(jìn)行 DNA 測序驗證突變序列的正確性。
5. 提供實(shí)驗結果，包括實(shí)驗操作規程、突變用引物、質(zhì)粒變異體以及含有該質(zhì)粒的菌種（穿刺菌）、測序結果、測序彩色峰圖等。
6. 1 kbp 以下的 DNA 片段克隆在普通載體上的單點(diǎn)突變的時(shí)間約需 10 天左右。

（三）收費標準

1. 為什么要進(jìn)行全基因合成？

最常見(jiàn)的獲得目的基因的方法是PCR 擴增釣取基因。但很多的時(shí)候，擴增只會(huì )得到痕量或根本就得不到目的基因。如果用這種方法，首先，必須準備某一特定組織的cDNA文庫，就必須花時(shí)間去準備 或訂購。其次，目的基因在文庫中的含量必須充足，否則就可能會(huì )找不到合適的方法釣取或克隆得到。第三，PCR擴增得到的目的基因可能會(huì )含有許多點(diǎn)突變或單 核苷酸多態(tài)性，這會(huì )給您后期的實(shí)驗應用帶來(lái)極大麻煩。

2.化學(xué)合成基因有哪些方法？

(1)全基因合成：一般對于分子較小而又不易得到的基因采用該方式?？蓪㈦p鏈基因分成若干寡核苷酸單鏈片段(尤其待 合成基因在100個(gè)核苷酸以上時(shí))，每個(gè)片段長(cháng)度控制在40～60個(gè)堿基，并使每對相鄰互補的片段之間有大于6bp交叉重疊。在體外將所有對應的片段混合 經(jīng)PCR反應即可拼接得到較長(cháng)的基因片段。采用分步連接、亞克隆的方法時(shí)，最后將亞克隆的較大片段重組為完整的基因。為便于亞克隆中回收基因片段，應在片 段兩側設計合適的酶切位點(diǎn)；由于每個(gè)亞克隆可以分別鑒定，從而可減少順序錯誤的可能性。 (2)酶促合成：此法又稱(chēng)基因的半合成法。全基因合成，特別是較大的基因的全部化學(xué)合成成本昂貴，使用半合成的方法 可以降低成本，從而利于普及使用。首先合成末端之間有10～14個(gè)互補堿基的寡核苷酸片段，退火后以重疊區作為引物，在4種dNTP存在的條件下，通過(guò) DNA聚合酶或反轉錄酶的作用，獲得兩條完整的互補雙鏈。合成基因的結構應包括有克隆和表達所需要的全部信號及DNA順序，基因密碼子的閱讀框架也應該同 表達體系相適應。此外，由于不同物種的密碼子使用偏好性，在基因合成和克隆時(shí)必須考慮這個(gè)問(wèn)題?？赏ㄟ^(guò)密碼子優(yōu)化獲得高效表達。

3. 桑尼公司的合成價(jià)格及周期時(shí)間如何?

基因全長(cháng)(正常難度) 價(jià)格 周期 ≤ 200bp 650.00元/基因 7-9 個(gè)工作日 201－2500bp 3.2元/堿基 10-15 個(gè)工作日 2500-4000bp 4.5 元/堿基 16-21個(gè)工作日起 > 4000bp 詢(xún)價(jià) 待定

4. 為什么基因合成的費用比引物合成高的多?

基因合成包括一個(gè)完整的流程：序列分析、優(yōu)化、引物設計與合成、引物拼接與PCR擴增，PCR產(chǎn)物的T/A克隆，測序篩選，點(diǎn)突變修復、發(fā)貨準備等一整套服務(wù)，而引物合成只是基因合成工作中的一小部分。

5. 質(zhì)量如何保證? 時(shí)間如何保證?

所有在桑尼公司合成的基因，都經(jīng)過(guò)100%測序驗證。桑尼公司基因部擁有獨立的分子生物學(xué)實(shí)驗平臺；本公司引物合成部、測序部，是基因合成部的根本保障?；蚝铣傻墓ぷ鲌F隊均經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)、嚴格的培訓，能保證所承接項目順利進(jìn)行。

6.什么樣的基因是復雜基因?

低GC含量序列：低GC含量的基因序列一般是指全長(cháng)GC含量低于20% 的基因，或100bp以?xún)菺C含量少于10%的序列；對于低GC片段，不包含發(fā)卡結構、反義互補、重復等其它復雜結構，一般將其分割成200bp/段來(lái)合 成，然后通過(guò)合適的內切限制酶酶切后連接（常用BsaI和BpiI，所以序列本身最好不含有這兩種酶切識別序列），這樣更易得到正確的克隆，但是發(fā)貨期將 比正常序列更長(cháng)一些，而且價(jià)格也比常規基因稍貴。一般低GC序列都可以合成并可通過(guò)測序驗證。 高GC含量：高GC序列一般是指GC含量高于70%的序列或100bp 以?xún)菺C含量高于80%的序列；與低GC序列不同，高GC序列難于測序，所以GC>75%的序列合成業(yè)務(wù)，請特別詢(xún)價(jià)，對于此類(lèi)序列也需要將其分割 成300bp的片段來(lái)合成，需要合適的內切限制酶，如BsaI 和 BpiI。 反義互補重復序列：由于此類(lèi)結構序列也不易于測序，所以我們一般不承接反義互補重復序列合成業(yè)務(wù)。 復雜基因與常規基因相比，合成費用較高，合成時(shí)間相對延長(cháng)。對于復雜基因，可通過(guò)密碼子優(yōu)化，盡量減少基因序列中的重復序列，高GC%區和二級結構區。

7.客戶(hù)收到的基因為什么質(zhì)粒切不動(dòng)，或切不全?

可能原因如下： (1) 質(zhì)粒上酶識別序列不正確或者沒(méi)有； (2) 酶切反應條件不合適； (3) 限制性?xún)惹忻笇NA甲基化敏感； (4) 內切酶稀釋不正確或加入方法不正確； (5) 甘油濃度過(guò)高； (6) 限制性?xún)惹忻敢巡糠只蛉渴Щ睿?(7) 保護堿基引入導致側翼鏈鎖死酶切位點(diǎn)。 對策： (1) 檢查質(zhì)粒DNA中是否存在可被限制酶識別的DNA序列。 (2) 優(yōu)化酶反應體系，使用隨酶提供的反應緩沖液；增大酶量或更換新酶。 (3) 檢查DNA是否已被甲基化，所用的酶是否對甲基化敏感。 (4) 更換保護堿基，或PCR擴增目的片段，酶切PCR產(chǎn)物。