DNA 甲基化對生命活動(dòng)非常重要，是基因調控的手段之一 ( 即通過(guò)對位于啟動(dòng)子及第一外顯子區的 CpG 島的甲基化而抑制基因的表達 )，它在基因表達調控、腫瘤研究、染色質(zhì)重塑、遺傳印記、疾病研究、胚胎發(fā)育、環(huán)境與表觀(guān)遺傳和表觀(guān)異質(zhì)性等方面起至關(guān)重要的作用，是表觀(guān)遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。

方案設計

全基因組甲基化實(shí)驗設計思路為差異比較，常見(jiàn)的類(lèi)型為實(shí)驗組與對照組 (case VS control)，進(jìn)行兩兩比較。通過(guò)重亞硫酸鹽對基因組 DNA 進(jìn)行處理，將未甲基化的 C 堿基轉化為 U 堿基，而甲基化的 C 則不會(huì )改變，進(jìn)行 PCR擴增后 U 堿基會(huì )變成 T，與原本具有甲基化修飾的 C 堿基區分開(kāi)來(lái)。 WGBS 精密度高，可以精確得到單個(gè)堿基，獲得單堿基精度生物甲基化圖譜。建議設置 3-6 個(gè)生物學(xué)重復，以減少組內誤差并增強結果的可靠性。

• WGBS對于物種有什么要求？

  1) 是否為低甲基化率的物種；已報道的低甲基化率的物種共有6種：果蠅、面粉甲蟲(chóng)、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、線(xiàn)蟲(chóng)和黃曲霉。

  2) 該物種的基因組完成情況如何（影響 Bisulfite-Seq 的比對，至少至少拼接到scaffold水平，較為完整的注釋?zhuān)?/span>

  3) 基因組是否存在復雜因素：GC 含量偏高、雜合度偏高、轉座子、重復區域等。

  4) 物種為真核生物。

• Bisulfite 處理后非甲基化 C 的 CT 轉化率是多少？

  目前我們的實(shí)驗流程很成熟，能保證 Bisulfite 處理后非甲基化 C 的 CT 轉化率在 99.5%以上，確保Bisulfite 對 DNA 的處理達到生物信息分析要求。如果樣品的DNA不存在不發(fā)生甲基化的DNA作為對照（例如：擬南芥的葉綠體的DNA都是不發(fā)生甲基化），都會(huì )在樣品中混入control DNA的方法來(lái)驗證Bisulfite的轉化率。

• WGBS推薦數據量多少？需要生物學(xué)重復嗎？

  通常WGBS甲基化建議測序深度為30X，生物學(xué)重復為兩個(gè)。如果研究同類(lèi)細胞的需要5-15X測序深度，如果需要研究區域較短的DMR需要15X以上的測序深度，如果想分析區域較長(cháng)的DMR測序深度達到1-2X即可。建議如果要分析DMR至少需要兩個(gè)生物學(xué)重復。