PacBio RS II是Pacific Biosciences公司研發(fā)的單分子實(shí)時(shí)測序系統（Single Molecule Real Time, SMRT），其專(zhuān)利的SMRT Cell含有15,000個(gè)納米級的零模波導孔（zero-mode waveguides, ZMWs），每個(gè)ZMW都能夠包含一個(gè)DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進(jìn)行單分子測序，并實(shí)時(shí)檢測插入堿基的熒光信號。

技術(shù)特點(diǎn)

超長(cháng)讀長(cháng)：最長(cháng)可達到40kb，提高拼接準確率和完整性；測序時(shí)間短：從DNA到數據只需10個(gè)小時(shí)；準確率高：對基因組組裝和基因組變異檢測，可以最多達到99.999%的準確率；敏感性強：可以檢測頻率在0.1%的minor variants；DNA起始量較低，最低只需要250ng；無(wú)PCR擴增偏好性：樣本不需要進(jìn)行PCR擴增，避免了覆蓋度不均一和PCR artifacts；最小的GC偏好性（GC bias）：在極端高GC和極端低GC區域，可以輕松測定，從而保證序列的均勻覆蓋度。

數據產(chǎn)出

應用領(lǐng)域

（1）全基因組de novo測序

與二代測序最高不超過(guò)1Kb的讀長(cháng)相比，PacBio RS II的長(cháng)讀長(cháng)將有效解決短序列數據的拼接難題。同時(shí)，與二代測序的模板樣品需要擴增相比，PacBio RS II無(wú)需擴增可直接對單個(gè)分子進(jìn)行測序，有效避免了PCR擴增偏好性和GC偏好性，PacBio RS II可輕松跨越GC含量異常（過(guò)高或過(guò)低）及高度序列重復的區域，實(shí)現序列覆蓋的完整性和均一性。

（2）基因組草圖的優(yōu)化或基因組完成圖繪制

對前期已開(kāi)展測序的動(dòng)植物、微生物等基因組結合三代長(cháng)讀長(cháng)測序數據進(jìn)行完善和提升。針對前期已經(jīng)開(kāi)展全基因組測序，獲得基因組草圖的動(dòng)植物、微生物等，可以結合PacBio RS II平臺長(cháng)讀長(cháng)reads進(jìn)行補充，從而快速獲得前期沒(méi)有測得的信息及提升基因組的完整度。另外還可以針對前期沒(méi)有檢測獲得的結構變異信息（structural-variation events）、串聯(lián)重復序列信息（tandem duplication）、易位信息（Inversion）等。尤其在微生物基因組完成圖的繪制中，可在一天之內、成本低于$1,000即可將基因組完善獲得0 gap contig。

（3）全長(cháng)轉錄本測序

PacBio RS II的長(cháng)讀長(cháng)可實(shí)現全長(cháng)轉錄本測序，并使基因可變剪接形式的識別成為可能，因此可以對新基因及其isoform進(jìn)行更全面的研究。同時(shí)，長(cháng)讀長(cháng)不再需要對RNA-Seq的reads進(jìn)行組裝，因此可以更完整的對基因模型和轉錄的基因進(jìn)行更全面的注釋?zhuān)靡愿倪M(jìn)參考基因組中的基因注釋信息。

（4）宏基因組測序

長(cháng)讀長(cháng)reads能夠更為精準地鑒定水體、土壤、腸道等生境中微生物的種類(lèi)的鑒定，能夠更加快捷地獲得更多微生物物種的全基因組序列。

（5）16S rDNA全長(cháng)測序

PacBio RS II的平均讀長(cháng)為8-10Kb，而16S rDNA長(cháng)度大約為1540bp，因此結合該平臺測序可以成功測序獲得16S的全長(cháng)序列。

（6）細胞器基因組測序

葉綠體基因組和線(xiàn)粒體基因組序列都包含重復序列、反向重復序列等復雜結構，PacBio RS II的長(cháng)讀長(cháng)可直接跨越這些區域獲得這些細胞器的全基因組序列信息等，基因組組裝不依賴(lài)于是否有近緣物種的線(xiàn)粒體和葉綠體基因組信息等、重測序能夠檢測到全面的SNPs及indel信息。

（7）全基因組重測序&稀有變異鑒定

PacBio RS II長(cháng)讀長(cháng)測序reads無(wú)GC偏好，能夠全面獲得基因組的遺傳變異，包括SNPs的鑒定到CNV、SV結構變異等，可運用至人類(lèi)癌癥基因組重測序等。PacBio RS II平臺10 小時(shí)即可完成測序，可應用至需要快速反饋的臨床檢測中，如細菌感染疾病中細菌的鑒定、病毒的鑒定等，取樣開(kāi)展重測序和目前已有的細菌、病毒基因組數據庫進(jìn)行比對鑒定即可。

（8）表觀(guān)遺傳學(xué)

PacBio RS II利用測序過(guò)程聚合酶反應的動(dòng)力學(xué)變化，首次實(shí)現對堿基修飾進(jìn)行直接測序。當堿基有額外修飾時(shí)，DNA聚合酶的合成速度會(huì )減慢，對應的信號會(huì )被檢測出來(lái)。每種堿基修飾事件都會(huì )使聚合酶的“停頓模式”P(pán)acBio RS II產(chǎn)生微小差異，最終反映到熒光脈沖信號的間隔上。除了甲基化修飾，還可以檢測5-hC、5-hmU、5-hU、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等堿基修飾，甚至可以鑒別傳統亞硫酸氫鹽測序法無(wú)法區分的甲基化修飾和羥甲基化修飾。PacBio平臺可以在測序的同時(shí)即可檢測表觀(guān)遺傳學(xué)修飾信息，只需對測序數據選擇合適的軟件即可分析堿基修飾信息。