1、測序儀：美國ABI公司 3730XL型
2、服務(wù)特色
i 速度快：:收到樣品后兩個(gè)工作日內出結果,為您贏(yíng)得寶貴時(shí)間。
ii 質(zhì)量?jì)?yōu)：: 單個(gè)反應讀取序列長(cháng)度在800bp以上,不僅能為您提供高質(zhì)量的測序報告,還能為您提供免費拼接序列、免費設計引物的超值服務(wù)。
iii 收費合理：在充分保證質(zhì)量的前提下，桑尼以物超所值的收費標準為您服務(wù)。
3、測序收樣注意事項
i 樣品為菌株
1)不論是通用載體還是自己構建的載體，送樣時(shí)請您務(wù)必注明培養基類(lèi)型、抗生素類(lèi)型、載體名稱(chēng)、測序引物。
2)對于特殊抗性、特殊培養條件的樣品，建議您提供已經(jīng)培養好的5ml菌液或沉淀好的菌體。
3)提供至少200ul的新鮮菌液，加甘油后冷凍保存的菌株請復蘇后再提供。若樣品太少會(huì )導致培養時(shí)間過(guò)長(cháng)甚至出現培養細菌失敗,以至延誤您的實(shí)驗。
4)我公司提供Amp,Kan,Cm,Tc四種抗生素,其它抗生素類(lèi)型請注明原液濃度及工作濃度隨樣品一起備齊。
ii 樣品為質(zhì)粒
1） 為確保測序的成功率和質(zhì)量，建議您盡量提供菌種測序。
2） 因特殊原因只能提供質(zhì)粒模板測序時(shí)，必須保證質(zhì)粒是高純度的，而且須溶解在滅菌的去離子水中，而不是TE溶液或其它含有鹽的溶液中。濃度大于100ng/ul，體積10ul以上。注明質(zhì)粒抽提方法。
3） 如果是病毒(包括噬菌體)DNA、低拷貝質(zhì)粒以及BAC DNA，請您純化好模板，我們將直接用于測序。
4）插入片段有特殊結構時(shí)必須注明，特別是含有通用引物的同源序列。
iii 樣品為PCR產(chǎn)物
1）原則上收取高質(zhì)量的PCR原液,片段大小為200-1500bp。取2-3ul原液電泳檢測應為明亮單一條帶。
2）注明提供PCR產(chǎn)物的體積、片段大小、濃度，是否經(jīng)過(guò)Agarose膠純化。未純化PCR產(chǎn)物體積不少于50ul，已純化PCR產(chǎn)物體積不少于10ul。
3）注明PCR測序引物的序列、濃度、體積以及純化方式。引物濃度不低于5pmol/ul,要求PAGE純化，體積10ul以上。
4）如果PCR產(chǎn)物純化由您自己完成，純化后的PCR產(chǎn)物要溶在滅菌的去離子水中，不能溶于TE中。
優(yōu)勢
1、 擁有先進(jìn)的實(shí)驗設備及完善的實(shí)驗流程，豐富的測序團隊管理經(jīng)驗。
2、 專(zhuān)業(yè)的測序團隊，積累了豐富的實(shí)戰經(jīng)驗：
個(gè)性化實(shí)驗方案：
A: GC rich、重復結構模板
B: poly結構、發(fā)卡結構模板
C: 16sRNA樣品
D: pET系列樣品
3、 更人性化的取樣方案：
A: 銷(xiāo)售代表取樣，更詳盡了解您的需求
B: 周末照常取樣，送樣，加快您的實(shí)驗進(jìn)度
4、 嚴格的保密制度，保護客戶(hù)樣品的安全性。
關(guān)于常規測序的更多詳細信息可復制鏈接：www.sunnybio.cn 搜索查看！
提供樣品時(shí)請注意：
1、菌液
如果提供菌液來(lái)測序，請提供0.5ml以上的新鮮菌液，我們會(huì )為您培養并免費抽提質(zhì)粒。 若您的菌株需要特殊培養條件，或為噬菌體，您最好提供5ml新?lián)u菌液的沉淀菌體，將沉淀菌體裝在離心管中，用封口膜封好后交給我們的工作人員或郵寄給我們。這樣我們可以直接抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序。
2、質(zhì)粒
如果您提供質(zhì)粒來(lái)測序，請用質(zhì)量較好的試劑盒抽提，以保證質(zhì)粒的純度可以達到全自動(dòng)熒光測序的要求。提供質(zhì)粒測序時(shí)，要求：濃度>100ng/微升，體積在10微升以上（對于每個(gè)樣品只測一個(gè)反應的情況）。如果每個(gè)樣品需測幾個(gè)反應，則送樣時(shí)需相應提高樣品的量。請將質(zhì)粒溶解在ddH2O中(請勿溶解在TE溶液中)。
注：無(wú)論您提供菌液或質(zhì)粒，請您務(wù)必寫(xiě)明載體的名稱(chēng)、插入片段的大小和位置、選用的測序引物名稱(chēng)或序列，并且盡可能的標明測序引物距離插入片段的位置(請您注意測序引物及引物后會(huì )有20-50個(gè)堿基不能準確讀出)。如果提供特殊測序引物，請一定寫(xiě)明引物濃度和序列，并且一定要提供高純度的引物，濃度要大于5pmol/ul。
3、PCR產(chǎn)物
如果您提供PCR產(chǎn)物原液來(lái)測序，請確信PCR產(chǎn)物為單一擴增條帶，片段大小在150—2000bp之間，且體積≥50ul，濃度≥50ng/ul。DNA總量必須大于2微克，由我們進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳割膠純化，然后再來(lái)測序。小于150bp和大于2Kb的DNA片段請克隆后再測序。
如果您提供已經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物來(lái)測序，請您一定進(jìn)行Agarose凝膠電泳純化，然后用質(zhì)量較好的試劑盒回收，將回收的DNA溶解在滅菌過(guò)的去離子水中（請不要溶解在TE中），并確信PCR產(chǎn)物為單一擴增條帶。要求：濃度>50ng/微升，提供10微升以上（對于每個(gè)樣品只測一個(gè)反應的情況）。如果每個(gè)樣品需測幾個(gè)反應，則送樣時(shí)需相應提高樣品的量。同時(shí)提供PCR引物，準確標明引物濃度，濃度要求大于5pmol/ul，并確信是高純度的引物。
由于PCR產(chǎn)物測序相對較難，為得到較好的測序結果，送樣時(shí)請盡量滿(mǎn)足上述要求。
常見(jiàn)問(wèn)題
1.DNA測序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL測序的準確程度如何？
DNA測序的原理是末端終止法。具體步驟如下： 1． 定量：對樣品及引物進(jìn)行定量。 2． 測序反應：在反應體系中加入已定量的模板和引物，BigDye等試劑，PCR儀上完成測序反應。 3． 讀取數據：根據熒光的不同，讀取被測樣品的堿基序列。 ABI公司目前承諾測序結果在800bp以?xún)葴蚀_率為98.5%。
2.為什么在測序報告上找不到我的引物序列？
如果您提供的樣品是PCR產(chǎn)物，在測序報告上找不到您的引物是正常的。這是因為測序反應是通過(guò)對被熒光標記的ddNTP的讀取而獲得基因序列的，而測序引物由于沒(méi)有熒光標記，因此自然在測序結果中就不會(huì )被識別。有兩種方法可以得到您的引物序列。對于較短的PCR產(chǎn)物（<800bp），可以用另一端的引物進(jìn)行測序，從另一端測序可以一直測到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互補序列。對于較長(cháng)的序列，一個(gè)測序反應測不到頭，因此就只能將您的PCR產(chǎn)物片段克隆到適當的載體中，用載體上的通用引物進(jìn)行測序。由于載體上的通用引物與您的插入序列之間還有一段距離，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測序的起始端總會(huì )有一些堿基無(wú)法準確讀出，因此，您如果想得到您的PCR產(chǎn)物的完整序列，最好克隆后進(jìn)行測序。 如果您提供的樣品是質(zhì)?；蚓?，PCR產(chǎn)物用T載體克隆后，由于克隆的方向是隨機的，因此，當您在一條鏈上找不到您的引物序列時(shí)，試圖在互補鏈上尋找您的引物序列。 當測序引物離您的插入片段很近時(shí)，有時(shí)可能也無(wú)法找到您的引物的全序列。這主要是因為有時(shí)測序的起始端由于未去除的染料或引物二聚體的干擾，造成起始區的序列不好，可能無(wú)法找到您的引物完整序列。 有時(shí)，質(zhì)粒做模板進(jìn)行測序時(shí)，由于某些原因，質(zhì)粒上沒(méi)有插入外源片段，為空載體，所測的序列完全為載體序列，此時(shí)自然也找不到引物序列。
3.我有一個(gè)大于2KB的PCR片段，希望你們幫我測通。
對于片段較大的PCR樣品我們建議您將其克隆進(jìn)載體后再做測通，因為一方面，PCR產(chǎn)物的純度不是很好掌握，因此測序的成功率不如質(zhì)粒和菌液測序。一般來(lái)說(shuō)，與PCR引物相比載體引物和模板結合的能力較好。 一般長(cháng)達1KB的模板需要兩個(gè)反應，才有可能得到完整準確的讀長(cháng)，大于1600bp的片段需要設計引物測通。對于要求我們?yōu)槟鷾y通的樣品，我們免費設計引物，但需要按堿基個(gè)數收取引物合成費用。
4.過(guò)短的PCR產(chǎn)物為什么不適于直接測序？
首先過(guò)短的PCR產(chǎn)物純化困難，一般的PCR產(chǎn)物純化試劑盒都要求PCR產(chǎn)物片段大于200bp，過(guò)短的PCR產(chǎn)物純化和準確定量都非常困難。因此我們要求用于測序的PCR產(chǎn)物一般不低于200bp長(cháng)度。 其次，由于測序本身的限制，以一個(gè)100bp的PCR產(chǎn)物用于測序為例，去掉兩個(gè)引物的序列大約40到50bp，再加上測序起始端的一些讀不出的堿基，真正能夠得到的有用序列不過(guò)30～40堿基。上面是在最理想的條件下的假設，稍不順利，測序就失敗了。因此，過(guò)短的PCR產(chǎn)物，只能克隆后進(jìn)行測序。
5. 我的引物做PCR效果很好，為什么用于測序總得不到好的結果？
用于測序的引物比用作PCR反應的引物要求高，以下是不適合用于測序反應的引物類(lèi)型： 1. 不純的引物：用于測序的引物純度要求很高，合成中的小片段會(huì )直接造成嚴重的背景峰，因此用于測序的引物序列長(cháng)度一般在24個(gè)堿基之內，因為過(guò)長(cháng)的引物純度不易保證。 2. 簡(jiǎn)并引物，隨機引物和有特殊標記的引物。
6. 我進(jìn)行PCR反應時(shí)，所用的退火溫度是59℃，是否可以用該溫度對我的樣品完成測序反應？
非常抱歉，目前我公司不會(huì )單獨對客戶(hù)的測序反應設定特定的條件，全部的測序反應均在統一的條件下完成。
8. 我的PCR產(chǎn)物為單一條帶，但未經(jīng)純化，是否可以直接送到貴公司進(jìn)行測序？
可以。我公司將為您進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠純化，目的在于去除PCR反應體系中的小片段、剩余dNTP及鹽分。
9. 我的PCR產(chǎn)物電泳檢測條帶單一，為什么測序結果說(shuō)模板雜？
PCR產(chǎn)物電泳檢測的結果只是一個(gè)粗略的定性結果。對于與目的片段條帶大小只相差幾個(gè)堿基的非特異性PCR擴增產(chǎn)物是無(wú)法用肉眼區分開(kāi)的。但是DNA測序反應敏感而客觀(guān)，可以直接反應出模板本身的情況。需要強調的是，高質(zhì)量的PCR產(chǎn)物才可能得到高質(zhì)量的測序結果，如果您對PCR產(chǎn)物的純度不很確定，希望您可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆處理，以確保得到好的測序結果。以下圖為例：該反應的背景信號較高，不利于堿基的判讀。
解決辦法：改變PCR條件，重新擴增?；蛘呖梢詫⒃揚CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，初步篩選后進(jìn)行單克隆測序。
10.什么是堿基缺失？
堿基缺失常見(jiàn)在PCR產(chǎn)物中，特別是從基因組中擴增得到的PCR片段，上圖的186位缺失兩個(gè)連續的T。
解決方法：1) 使用反向引物繼續測序，以矯正缺失位點(diǎn)并達到測通的目的?；蛘邔⒃揚CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，挑取單克隆測序。
2) 如果可以確定該PCR片段中不應該有缺失的位點(diǎn)，那么可以改變PCR反應條件，重新擴增。
11.什么是引物不純？
引物不純造成移碼現象，該種現象與模板雜在峰圖都表現為背景峰較雜，但是引物不純在峰圖上表現的更有規律，一般在每一個(gè)主峰前都有一個(gè)同一堿基的小峰。
解決方法：重新合成引物，或者將引物進(jìn)行PAGE純化后再進(jìn)行測序。
12.重復結構對測序有哪些影響？
重復結構將導致測序復制框的滑移，重復結構之后峰型混亂。
解決辦法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該重復結構處，即可完成模板全長(cháng)的拼接。
13.什么是模板不單一？
上圖是pGEM-T載體測序的結果，在83位點(diǎn)處測序結果出現雙峰，即測序結果在載體部分很準確，而進(jìn)入插入片段后出現雙峰的情況。這是由于在接種時(shí)沒(méi)有挑單菌落導致的，當兩個(gè)以上的正常的克?。ú迦肫畏较蛳喾矗?，或正?？寺∨c空載體混在一起，而通過(guò)酶切和PCR鑒定很難看出異常，尤其在T-A克隆時(shí)經(jīng)常碰到。
解決辦法：重新涂平板挑單菌落測序。需要注意的是，重新進(jìn)行PCR反應或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。
對于PCR產(chǎn)物也同樣有模板不單一的情況，如下圖所示，
在197bp前測序峰表現為雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一個(gè)高高的A峰，峰標志著(zhù)此PCR產(chǎn)物中有一個(gè)片段大小為200bp左右的小片段。
解決方法：對PCR產(chǎn)物切膠純化，再進(jìn)行測序。
14. poly結構的測序結果是怎樣的？
以polyT為例，在polyA/T結構之后往往出現移碼現象，而在polyG/C之后會(huì )往往導致測序信號的衰減。
解決辦法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該poly結構處，即可完成模板全長(cháng)的拼接。
15.含有回文結構的模板測序結果是怎樣的？
位點(diǎn)94至137是一個(gè)回文結構，該結構導致后面的信號衰減，出現錯誤的判讀。
解決方法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該回文結構處，即可完成模板全長(cháng)的拼接。
16.鹽分高的情況是怎樣造成的？
鹽分高是指客戶(hù)提供的PCR產(chǎn)物中的鹽離子濃度高。造成樣品鹽離子高的原因是由于客戶(hù)在進(jìn)行PCR反應時(shí)，在反應體系中加入的鹽離子濃度過(guò)高。鹽離子的來(lái)源有PCR反應體系中的緩沖液即buffer，有些情況下是由單獨加入的鎂離子造成的。對于這種樣品，通過(guò)電泳檢測是不能對其進(jìn)行區分的，只有在測序結果出來(lái)后分析峰圖才可能發(fā)現問(wèn)題所在，典型的峰圖表現為前70-80甚至100個(gè)堿基的峰型基線(xiàn)漂離，嚴重影響測序結果前面部分的準確性。由于通過(guò)純化的方法只能部分的去除少量鹽分，無(wú)法徹底解決鹽離子對測序結果的影響，最佳的解決方法是請客戶(hù)調整PCR反應體系，重新送樣。
