1. 如何測定引物的OD值？
用紫外分光光度計在260nm波長(cháng)測定溶液的吸光度來(lái)定量，請注意紫外分光光度計的使用，測定時(shí)溶液的吸光度最好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會(huì )有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標準比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進(jìn)而可以計算出母液的OD值。 舉例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml并在1ml標準比色杯中測定的吸光度為0.25，說(shuō)明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說(shuō)明原來(lái)1ml母液中含有5OD的DNA。
2. 如何檢測引物的純度？
實(shí)驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,<12個(gè)堿基的引物用20%的膠，12-60個(gè)堿基的引物用16%的膠，>60個(gè)堿基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95oC,2min)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒(méi)有雜帶，說(shuō)明純度是好的(有時(shí)由于變性不充分，主帶之上可能會(huì )有條帶，乃是引物二級結構條帶)。
3. 合成引物的稀釋與保存?
初始拿到的DNA，其性狀為薄膜狀或者粉末狀的白色粉末，附在離心管內壁上。稀釋前，請將引物管離心數秒使DNA聚集到管低，小心開(kāi)啟管蓋，以免引起粉末飛揚造成DNA損失，再加入適量的TE緩沖液，蓋好管蓋，漩渦振蕩混勻并使其充分溶解。建議將引物稀釋于TE（10mM Tris-HCL，pH8.0，1mM EDTA）溶液中，濃度高于10μM，并于-200C儲存。 例如：如果您需要稀釋到10μM，只需要加入（管內總nmol數/10）ml的TE即可。沒(méi)有溶解的引物非常穩定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲存液，分裝數份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復多次凍融會(huì )降低使用壽命）。
4. 熒光標記的DNA如何稀釋與保存？
熒光標記（如HEX,TET,FAM,Cy3，Cy5等）的DNA對光較敏感，在合成及運輸過(guò)程中，此類(lèi)引物應確保最大程度的避光。接到合成引物后，請立即避光保存。對于非Cy類(lèi)的熒光標記引物，建議將引物稀釋于TE溶液中，濃度高于10μM，并于-20℃儲存于暗盒中。Cy3及Cy5標記的引物在堿性條件下易降解，所以此類(lèi)引物應于中性條件下在-20℃避光保存。
5. 一般的合成的引物在5"和3"末端有磷酸基團嗎?
沒(méi)有，5"和3"末端均為-OH基。如需要加磷酸基團，訂貨時(shí)請特別注明，此時(shí)需收取磷酸化的費用。
6. 如何將兩條互補的單鏈退火形成雙鏈？
用退火緩沖液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解引物, 將要退火的引物等摩爾數混合，總體積不要超過(guò)500微升，加熱到95℃ 2mins，然后緩慢冷卻至室溫(低于30度)即可。退火的產(chǎn)物可以放在4度待用。
7. 引物在常溫下運輸，會(huì )降解嗎？
不會(huì )降解，干燥的引物在常溫至少可以穩定存放二周以上。而一般的運輸時(shí)間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會(huì )降解。
8. 合成的引物進(jìn)行PCR反應時(shí)無(wú)目的帶，怎么辦?
PCR反應失敗的原因很多，可以從以下幾個(gè)方面考慮。 1) 引物和模板是否配對，同源性有多大？ 2) 引物本身是否有立體結構？ 3) PCR反應用試劑是否能正常工作? 4) PCR儀是否工作正常? 5) PCR反應條件是否合適? 如果一切正常，還無(wú)法解決問(wèn)題時(shí)，我們可以免費重新合成引物。
9. 已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過(guò)一段時(shí)間再使用就不好了？
如果您溶解引物的水PH過(guò)低或污染了菌或核酸酶，會(huì )使引物降解。使用時(shí)沒(méi)有充分解凍混合，液體不均勻也可能會(huì )造成引物加入量不準確。建議分裝引物，避免反復凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒(méi)有問(wèn)題，而是PCR使用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用的不完全一致。
10. 引物純化方式有哪些，如何選擇？
◆ C18柱脫鹽：有人稱(chēng)其為簡(jiǎn)易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶解洗脫，但不會(huì )被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實(shí)際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會(huì )對普通PCR反應產(chǎn)生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個(gè)級別。 ◆ PAGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長(cháng)鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。 ◆ HPLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進(jìn)行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點(diǎn)是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高。
11. 如何計算引物的Tm值？
引物設計軟件都可以給出Tm，引物長(cháng)度，堿基組成，引物使用緩沖的離子強度有關(guān)。 長(cháng)度為25mer以下的引物，Tm計算公式為：Tm = 4℃(G C) 2℃(A T) 對于更長(cháng)的寡聚核苷酸，Tm計算公式為： Tm = 81.5 16.6 x Log10[Na ] 0.41 (%GC) – 600/size 公式中，Size =引物長(cháng)度。
12. 引物（含修飾）的分子量是如何確定的？
非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報告單上都有明確的標示。如果需要估計一個(gè)引物的分子量按每個(gè)堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數 x堿基的平均分子量?；虬聪铝泄接嬎鉓W= (NA * WA) (NC * WC) (NG * WG) (NT * WT) (Nmod * Wmod)＋（Nx * Wx） ( Ni* Wi) 16* Ns– 62.NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數量，WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod, 分別為修飾基團的數目和分子量。 對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數，例如G A混合的分子量為（313.21 329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數目，硫代每個(gè)位置增加分子量16。 常規堿基分子量
13.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問(wèn)題？
連接反應需要引物的5’磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱(chēng)結構，退火的難度較大，退火時(shí)需要提高退火溫度。
14.測序發(fā)現引物有突變是怎么回事？
測序發(fā)現引物區域有突變，特別是40個(gè)堿基以下的引物,發(fā)生的概率不大，但是肯定也會(huì )發(fā)生。用戶(hù)一般可以放心，引物序列一般都是通過(guò)電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯的機會(huì )不多。我們有一套控制辦法，預防堿基輸入錯誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋?zhuān)藗冞€沒(méi)有辦法徹底解決這個(gè)問(wèn)題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機器也基本相同，合成主要原料都是由可數的幾家跨國公司提供的，所有每個(gè)合成服務(wù)商遇到的問(wèn)題也基本類(lèi)似，沒(méi)有人可以超脫。 引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應，合成效率最高也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復，一般認為，偶連過(guò)程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應不徹底造成的，Caping反應主要是封閉極少數5"-羥基沒(méi)有參加反應單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時(shí)將不能繼續參與合成。對于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認為是堿基不能100%脫保護，即引物上可能含有殘留保護基團，引物的這些區域不能很好地與互補鏈配對，當擴增的產(chǎn)品被亞克隆轉化到大腸桿菌中，可能被細菌中修復系統補上了非配對的堿基。置換突變通常發(fā)生在G轉換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉化為烯醇異構體 （脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA復制和擴增過(guò)程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測序就會(huì )發(fā)現堿基G-A置換。脫嘌呤現象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解，測序就會(huì )發(fā)現堿基G或A的缺失。 引物合成過(guò)程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀(guān)存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實(shí)驗室階段，還沒(méi)有能夠應用到規?；a(chǎn)中。
15.長(cháng)鏈引物為什么出錯的幾率非常高？
引物合成時(shí)，每一步反應效率都不能達到100%，產(chǎn)生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀(guān)條件都有一直存在。引物鏈越長(cháng)，突變的頻率加起來(lái)就越高。研究人員總希望合成的引物萬(wàn)無(wú)一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能絕對保證擴增產(chǎn)物中沒(méi)有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過(guò)程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長(cháng)鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。
16.引物是經(jīng)過(guò)PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？
理論上分析型PAGE變性電泳，可以區分引物之間一個(gè)堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，很難說(shuō)不割到差別僅幾個(gè)堿基的引物。國內有一個(gè)不好的現象，PAGE純化的引物，特別是長(cháng)引物要的量都比較高，導致割的條帶有時(shí)可能比較寬。建議：您如果減少OD數，引物遇到的問(wèn)題可能就會(huì )少一些。
17.為什么OPC或PAGE純化的引物，再用HPLC鑒定純度不高？
有些用戶(hù)引物需要純度特別高的引物，在使用前會(huì )將HPLC鑒定引物的純度，常常發(fā)現引物的純度一般在70%左右。問(wèn)題來(lái)了，還有那30%是什么？ 引物純化PAGE,需要電泳，用緩沖液將引物浸泡出來(lái)，然后用C18濃縮，乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物質(zhì)基本引物了，除此以外，還有其他一些非核酸類(lèi)物質(zhì)，他們一般不會(huì )干擾引物的使用。OPC純化也類(lèi)似的情況。即使是HPLC純化的引物，如果對成品進(jìn)行分析，一般也難達到很高的純度，引物您得到的純品都是由制備柱過(guò)來(lái)，洗脫峰經(jīng)過(guò)濃縮抽干，部分非核酸物質(zhì)被富集。
18.為什么修飾引物的產(chǎn)量要比一般引物低，價(jià)格要高?
主要因為是修飾單體穩定性較差，偶連時(shí)間長(cháng)，效率低，最后得到的產(chǎn)量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化過(guò)程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產(chǎn)品的價(jià)格自然高。
19.引物不純會(huì )有什么后果？
引物不純可能會(huì )導致：1)非特異性擴增；2)無(wú)法用預先設計在引物5"端酶切位點(diǎn)的酶切開(kāi)，特別是沒(méi)有保護堿基的引物；3)用于測序出現雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。
20.為什么我們的引物重合了幾遍都擴增不出來(lái)？
有些PCR擴增沒(méi)有成功，懷疑是引物不好。要求我們重合，沒(méi)有問(wèn)題?？墒怯袝r(shí)遇到重合數次的引物PCR擴增還是不成功。這種情況的出現一般都是用戶(hù)自己的原因。對于引物合成，我們只能做到合成的引物沒(méi)有問(wèn)題，至于您是否能夠擴增出來(lái)您需要的產(chǎn)物，那得靠您自己對實(shí)驗本身的理解和把握。我們不能杜絕我們不犯錯誤，但是引物合成犯同樣錯誤的幾率很小，想犯同樣的錯誤都難。 PCR擴增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在實(shí)驗時(shí)設置對照來(lái)判定原因。 如果您懷疑引物的問(wèn)題，請您首先測定您溶解的引物的OD值，看實(shí)驗時(shí)加入的引物量是否正確。如果量是正常的，請您告訴我司您的引物編號，我們會(huì )復查留存樣品。如不明原因，我們免費為您重新合成一次。如果仍然不能擴增，請您查找其它原因。
